冷凍保藏菌種有哪些切實可行的方法?

冷凍保藏是指將菌種于-20 ℃以下的溫度保藏， 冷凍保藏為微生物菌種保藏十分有效的辦法。經過冷凍，使微生物代謝活動中止。一般而言，冷凍溫度愈低，作用愈好。為了保藏的成果愈加令人滿意，通常在培育物中加入一定的冷凍保護劑;一起還要認真掌握好冷凍速度和解凍速度。冷凍保藏的缺陷是培育物運輸較困難。

*先要給大家說的就是液氮冷凍保藏技術：近年來，大量有特殊意義和特征的高等動、植物細胞能夠在液氮中長期保藏，并發現在液氮中保藏的菌種的存活率遠比其他保藏方法高且回復突變的發生率極低。液氮保藏巳成為工業微生物菌種保藏的*好方法。具體方法是：把細胞懸浮于一定的分散劑中或是把在瓊脂培養基上培養好的菌種直接進行液體冷凍，然后移至液氮(-196 ℃)或其蒸汽相中(-l56 ℃)保藏。進行液氮冷凍保藏時應嚴格控制致冷速度。液氮冷凍保藏微生物菌種的步驟是先制備冷凍保藏菌種的細胞懸液，分裝0.5～1 mL入玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精噴燈封口。然后以(1-2) ℃/min的致冷速度降溫，直到溫度達到相對溫度之上幾度的細胞凍結點(通常為-30 ℃)。待細胞凍結后，將致冷速度降為1 ℃/min，直到溫度達到-50 ℃，將安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196 ℃)或氣相(-156 ℃)中保存。如果無控速冷凍機，則一般可用如下方法代替：將安瓿或液氮瓶置于-70 ℃冰箱中冷凍4 h，然后迅速移入液氮罐中保存。在液氮冷凍保藏中，*常用的冷凍保護劑是二甲亞砜和甘油，*終使用濃度一般為甘油10 %、二甲亞砜5 %。所使用的甘油一般用高壓蒸汽滅菌，而二甲亞砜*好為過濾滅菌。

普通冷凍保藏技術(-20 ℃)：將菌種培養在小的試管或培養瓶斜面上，待生長適度后，將試管或瓶口用橡膠塞嚴格封好，于冰箱的冷藏室中貯藏，或于溫度范圍在-5～20 ℃的普通冰箱中保存。或者將液體培養物或從瓊脂斜面培養物收獲的細胞分別接到試管或指管內，嚴格密封后，同上置于冰箱中保存。用此方法可以維持若干微生物的活力1～2年。應注意的是經過一次解凍的菌株培養物不宜再用來保藏。這一方法雖簡便易行，但不適宜多數微生物的長期保藏。

超低溫冷凍保藏技術：要求長期保藏的微生物菌種，一般都應在-60 ℃以下的超低溫冷藏柜中進行保藏。超低溫冷凍保藏的一般方法是：先離心收獲對數生長中期至后期的微生物細胞，再用新鮮培養基重新懸浮所收獲的細胞，然后加入等體積的20 %甘油或10 %二甲

亞砜冷凍保護劑，混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中，于-70 ℃超低溫冰箱中保藏。超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在(1～2) ℃/min。若干細菌和真菌菌種可通過此保藏方法保藏5年而活力不受影響。

真空凍干保藏：真空冷凍干燥的基本方法是先將菌種培養到*大穩定期后，一般培養放線菌和絲狀真菌約需(7～10) d，培養細菌約需(24～28) h，培養酵母約需3 d。然后混懸于含有保護劑的溶液中，保護劑常選用脫脂乳、蔗糖、動物血清、谷氨酸鈉等，菌液濃度為(109～1019)個/mL，取(0.1～0.2) mL菌懸液置于安瓿管中冷凍，再于減壓條件下使凍結的細胞懸液中的水分升華至1 %～5 %，使培養物干燥。*后將管口熔封，保存在常溫下或冰箱中。此法是微生物菌種長期保藏的*為有效的方法之一，大部分微生物菌種可以在凍干狀態下保藏10年之久而不喪失活力。而且經凍干后的菌株無需進行冷凍保藏，便于運輸。但操作過程復雜，并要求一定的設備條件。